万历三十年（1602年1月23日─1603年2月10日）圣保禄教堂重建奠基，由佩德罗•卡瓦略神父主持。这次重建的奠基石碑至今犹存：Virgini Magnae Marti Civitas Macaensis Libens posuit An. 1602. 意思是：1602年澳门市民为童贞天主圣母所建。

万历三十一年（1603年2月11日─1604年1月30日）12月24日，新圣保禄教堂正式落成。教堂有160掌长，84掌宽。正面3座大门朝南洞开。石砌墙壁约50掌。堂身依三路伸展构成3个祭堂，即一个主堂及两个侧堂。数个祭堂沿教堂两侧排列，后部左右两翼各有一祭坛：圣灵坛与圣米格尔堂。圣堂供奉《圣母玛利亚升天图》。主堂长62掌，宽44掌，唱诗坛旁摆放两台风琴。教堂旁还建有一座钟楼，其大钟是由后来法王路易十四（Louis ⅩⅣ）赠送。1637年到澳门的英国旅行家彼特•芒迪（Peter Mundy）参观该教堂后称：“教堂屋顶是我见过最漂亮的拱形建筑。中国人巧夺天工，木制雕刻以新奇古怪的红、蓝等色彩勾画得美轮美奂。整个穹窿为若干四面体，而每个四方形之间以巨大玫瑰花和绿叶重叠相连。”教堂工程由瓦伦廷•卡瓦略神父主持，设计师为卡罗斯•斯皮诺拉（Carlos Spinola），但斯皮诺拉却未看到自己设计的成果，于1602年7月就已经赴日传教，他在澳门停留仅1年10个月。