嘉靖四十四年(1565年2月1日─1566年1月20日)本年，戈伊斯使團文書若奧•埃斯科巴爾在澳門撰寫《關於至高至強之塞巴斯蒂昂國王派往中國使節團的述評》一書，記錄了1564年廣東副總兵湯克寬曾派官員到澳門與葡萄牙人洽商一事，其中還記錄了澳門媽閣廟：“事情至此，那位官員派人對唐•若奧(D. João)說，他將登岸到廟中與其會面，將事議妥。為不耽誤時間，請他也照做。唐•若奧認為此議甚好，前往該地會面。它位於村落的端點，面對大海。”這座位於澳門“村落的端點、面對大海”的廟就是媽閣廟(Templo de A-Má)。媽閣廟始建於何時，目前尚無明確的文獻證據，但這一條史料可以證明，嘉靖四十四年(1565)前澳門即有媽閣廟。而且，廣東官府利用這一廟宇作為與葡人首領會晤的地點，亦可說明當時的媽閣廟即已具備“官廟”的性質。林旭登《葡屬印度水路志》採用1587年以前的資料描寫澳門內港景象稱：從澳門啟航，你們在東北方向可以看見一座山(對面山)上有一白色標記。東邊還有兩個山丘。在第二座山丘(鳳凰山)與山之間的那個丘陵(青洲)完全禿裸。見到它後，你們要在位於水道中央的沙梨頭的岩石及礁石之間穿行。該水道位於當地最後一批大宅附近。一到這些房子處，你們可以看到第三座山崗(媽閣山)。靠近該地岬角處稱官廟(Verella dos Mandarins)。上述山丘幾乎完全禿裸。此處水深5托。往大海方向，水半深。過了這個岬角，水面加深，可至5或6托半。按此方法航行，你們可以見到馬騮洲對面隆起的陸地。林旭登所言之官廟亦應為媽閣廟。

萬曆三十三年（1605年2月18日─1606年2月6日）5—6月，欽差總督廣東珠池市舶稅務兼管鹽法太監李鳳與信官王權、梁宗翰等人主持，由澳門四街華商出資重建媽閣廟“神山第一亭”完成。澳門“四街”即“十字街”，這是一條縱街與一條橫街交叉而成的十字街，被明廷分別命名為“畏字街”、“威字街”、“懷字街”、“德字街”。這十字街本是諸夷建造居住。後多為華商租賃，葡人居樓上，唐人居樓下。