鴉片戰爭後，澳門的貿易的地位受到威脅，葡萄牙皇室對澳門進行殖民化，強行推出“自由港”政策，試圖改變困境。1846年，澳門總督亞馬留上任後，以強硬手段推行殖民統治，包括向華人徵稅、向城外村落擴張，以及破壞清朝對澳門的管治權，使澳葡政府與清朝陷入緊張關係。直到1852年，葡萄牙政府採取讓步，雙方的關係才有所緩和，但葡萄牙人並沒有放棄控制澳門。在1864年，澳葡政府藉著清朝在英法聯軍之役大敗，草簽了《中葡和好貿易條約》，試圖讓清朝承認葡萄牙對澳門的控制權，及後因修改條約出現分歧而沒有成為有效的法律文件。
儘管簽約未果，澳葡政府仍然向望廈、龍田、沙梨頭、塔石、氹仔和路環進行擴張。直到1887年，清朝與葡萄牙再次就澳門的管治權進行談判，簽訂《中葡友好通商條約》，承認葡萄牙人“永居”澳門，但澳門的地界問題仍未解決，並展開新一輪的爭議。
在澳葡政府的統治下，葡萄牙人推出專營承充制來增加收入，並把苦力貿易、賭業、鴉片貿易等納入其中，這些行業曾一度成為政府的收入來源。另外，擁有較多財富的華商參與政商活動，他們不僅參與土地開發和推動工業，也組織本地的慈善機構為居民服務。
19世紀末、20世紀初，中國人民反抗列強侵略、拯救民族危亡之際，改良變革思潮風起雲湧。澳門由於其鄰近廣東的地理位置和受葡人管治的政治環境，為維新派、革命派的活動提供了特殊的空間。鄭觀應、康有為、梁啟超都曾在澳門積極開展活動，而中國民主革命先行者孫中山也在不同時期以澳門為基地，開創革命事業。